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    分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

    發(fā)布時間: 2023-01-06  點(diǎn)擊次數(shù): 1132次

    材料與儀器

    D-PBSA 胰蛋白酶 EDTA 人臍帶 膠原蛋內(nèi)酶H 冷的新生小牛血
    Hank平衡鹽溶液 HBSS PSG 70%乙醇 HUVRC生長培養(yǎng)液
    培養(yǎng)瓶 手術(shù)刀和22號刀片 手術(shù)針 20ml注射器 鱷魚夾 動脈夾 尖頭剪棉紙 鋁箔 塑料薄膜或莎綸封皮 軟木板 很堅韌的線 Luer接合管

    步驟

    內(nèi)皮細(xì)胞的分離

    1. 用鋁箔覆蓋軟木板。

    2. 將棉紙鋪在鋁箔上面,然后用 70 % 乙醇浸泡。

    3. 擠出臍帶中的血液。

    4. 切除臍帶一端 2 cm 或 2 cm 以上,包括動脈夾痕跡處。

    5. 將 Luer 接合管外套插入靜脈。

    6. 用針將臍帶釘在軟木板上,但注意勿穿經(jīng)血管腔。

    7. 用手術(shù)刀和手術(shù)鑷剝出一段靜脈,長約 2 cm。

    8. 縫線固定接合管,緊緊打結(jié)兩次。

    9. 夾閉臍帶另一端,將 20 ml 注射器接在接合管上,再將 25 ml D-PBSA (放在冰上)注入臍帶。靠 D-PBSA 的壓力將靜脈擴(kuò)張。檢査臍帶是否有小孔。如有小孔,用鱷魚夾夾持臍帶,使小孔閉合,但不要夾閉靜脈。

    10. 將 D-PBSA 自臍帶排人廢液瓶。

    11. 切除臍帶另一端,插入接合管,如步驟 8 縫線固定。

    12. 用另一只注射器將 25 ml 膠原蛋白酶液(膠原蛋內(nèi)酶 H:是從溶組織梭狀芽孢桿菌提純的(1074059,Roche)。0.5 mg/ml, 用 M199 配制 25 ml)注入臍帶,直至臍帶膨脹。

    13. 用乙醇噴過的塑料薄膜將臍帶包裹,在 37°C 條件下放置 8 min。

    14. 將膠原蛋白酶液擠出臍帶,同時回抽注射器。

    15. 拔出注射器,將膠原蛋白酶液注入含有 5 ml NBS(冷的新生小牛血清,5 ml) 的試管。

    16. 在臍帶另一端換注射器,將 25 ml D-PBSA 注入臍帶。

    17. 擠壓或拍打整段臍帶一會兒,然后用此端的注射器抽取 D-PBSA。

    18. 將抽取的 D-PBSA 注入在步驟 15 使用的試管。

    19. 在 4°C  條件下離心(210 g,10 min)。

    20. 用 5 ml HUVFC 生長培養(yǎng)液混懸細(xì)胞。

    21. 吸去培養(yǎng)瓶內(nèi)多余的明膠溶液,接種細(xì)胞。

    22. 第 2 天從培養(yǎng)瓶吸去培養(yǎng)液。

    23. 用 D-PBSA 洗兩次,然后加入 HUVEC 生長培養(yǎng)液(M 199 培養(yǎng)液,添加 Hank 鹽、2 mmol/L 谷氨酰胺、25 mmol/L HEPES、20% FBS、150 U/ml 青霉素和鏈霉素混合液以及從牛腦提純的內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(endothelial cell growth supplement,ECGS)。使用 Roche 公司生產(chǎn)的 EGGS (1033484,75 mg)時,25 μg/ml,并用 5 μg/ml 肝素,也可使用 Sigma 公司的產(chǎn)品(E2759,15 mg),30 μg/ml,并用 10 μg/ml 肝素)。

    維持培養(yǎng)

    24. 吸去一半培養(yǎng)液,加入新鮮培養(yǎng)液,每周 3 次。

    25. 大約每周傳代一次。將胰蛋白酶和 EDTA 混合液加入培養(yǎng)瓶,收集細(xì)胞,然后按 1 : 2 傳代。

    26. 不要使用超過 6 代的細(xì)胞。


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