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    免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞毒性較高是為何?

    發(fā)布時間: 2023-01-05  點(diǎn)擊次數(shù): 1444次
       免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染時先吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗?次。更換無血清培養(yǎng)基。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染制備液,?滅菌后的EP管制備。以六孔板為例,A液-200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液-200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000,分別將A液、B液輕輕混勻,靜置5min,吸取B液加至A液中,輕輕混勻,室溫靜置20min。
      加?轉(zhuǎn)染試劑到每個孔的培養(yǎng)基中,6h后,更換成全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時。
      免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染24h后需要觀察轉(zhuǎn)染過程對細(xì)胞毒性情況,如果毒性較高,可能是以下原因造成的:
      1.初期細(xì)胞接種濃度太低。
      2.轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入量過高,因?yàn)椴煌?xì)胞對轉(zhuǎn)染的敏感度不同。
      3.轉(zhuǎn)染后6小時需更換培養(yǎng)基,一是lipo2000具有一定毒性,二是培養(yǎng)基需要更換成有血清培養(yǎng)基。其次,轉(zhuǎn)染后需要對轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測,比如觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光情況、qPCR驗(yàn)證或WB檢測敲減或者過表達(dá)蛋白。
      4.對于β-gal表達(dá)載體:可用β-gal染色試劑盒進(jìn)行細(xì)胞染色并觀察細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效率高的細(xì)胞在染色孵育后3-4h即可觀察到,轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞則需要更長的孵育時間。
      5.對于GFP表達(dá)載體:熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。如果細(xì)胞能在顯微鏡下被觀察到,至少需要有104-105拷貝的GFP蛋白表達(dá),表達(dá)太弱的細(xì)胞無法鏡檢。GFP表達(dá)情況也能使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,同時可加入PI進(jìn)行染色以監(jiān)測死細(xì)胞情況。
      若是轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高,可通過以下兩種方法增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效率:
      1.復(fù)轉(zhuǎn)染,即轉(zhuǎn)染后12-24小時再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染,前提是該細(xì)胞對脂質(zhì)體的耐受性較好,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡數(shù)較少;
      2.通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細(xì)胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因。
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