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RNAiMAX轉(zhuǎn)染的主要途徑探討
發(fā)布時間： 2022-04-11 點擊次數(shù)： 2640次RNAiMAX轉(zhuǎn)染是指將外源分子RNA導(dǎo)入真核細胞的技術(shù)，它是研究基因表達調(diào)控，突變分析等的常規(guī)工具。細胞轉(zhuǎn)染可分瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不整合到細胞的染色體上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指DNA整合到宿主細胞的染色體中。RNAiMAX轉(zhuǎn)染的一般途徑如下：一、物理介導(dǎo)1.電穿孔法電穿孔靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細胞內(nèi)。本法需用特殊設(shè)置（電穿孔儀），把懸浮狀態(tài)的受體細胞和供體RNA共同放入皿中（或杯中），再施以高壓電脈沖，能夠促進RNA通過細胞膜而進入胞內(nèi)，并可整合到細胞的RNA中，使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。若轉(zhuǎn)移的RNA為帶有選擇標記基因的質(zhì)粒，也可在選擇培養(yǎng)基中進行鑒定。2.顯微注射本法是借助顯微注射器直接把RNA注射入核內(nèi)，使之發(fā)生整合入受體細胞基因組中的技術(shù)。本技術(shù)需要有嚴密無菌的凈化室，以免敞開操作污染，同時要能有自動拉針儀以制備顯微針，一般用手動拉針器拉制時要能使針末端有一個0.6cm長的細部，太長易折斷，針尖開口為2-3μm間，針口小于1μm更佳，針尖開口大于5μm易刺傷細胞。3.基因槍基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細胞內(nèi)?？梢詫⒋蠓肿訉?dǎo)入細胞。二、化學介導(dǎo)1.磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣被認為有利于促進外源RNA與靶細胞表面的結(jié)合。氯化鈣+RNA+磷酸緩沖液按一定的比例混合，形成極小的磷酸鈣-RNA復(fù)合物沉淀黏附在細胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹RNA，借助脂質(zhì)膜將RNA導(dǎo)入細胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體則不同，RNA并沒有欲先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的RNA自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成RNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細胞。3.多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，原理可能是通過內(nèi)吞噬作用而使RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細胞核，此法只適合暫時轉(zhuǎn)染實驗。不適用與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時要除去血清。三、生物介導(dǎo)病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，以病毒作為載體，通過病毒感染的方式將外源RNA導(dǎo)入到細胞中，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染體系常用。
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