細(xì)胞鋪板是細(xì)胞實驗中的基礎(chǔ)操作，其目的是將細(xì)胞均勻分布在培養(yǎng)板上，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。下面為你介紹詳細(xì)操作流程：

1.實驗準(zhǔn)備

材料：細(xì)胞懸液、培養(yǎng)基、胰酶、PBS 緩沖液、血清、96 孔板或 24 孔板等培養(yǎng)板。

器材：移液器及配套槍頭、離心機、細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡。

試劑配制：提前配制好含 10% 血清的培養(yǎng)基，若細(xì)胞貼壁性差，還需用多聚賴氨酸對培養(yǎng)板進行包被處理，即將適量多聚賴氨酸溶液加入培養(yǎng)板各孔，室溫孵育 1-2 小時，吸去溶液，用 PBS 沖洗 2-3 次，晾干備用。

2.細(xì)胞懸液制備

取出細(xì)胞：從培養(yǎng)箱中取出長滿細(xì)胞的培養(yǎng)瓶，在超凈工作臺內(nèi)，用移液器吸去瓶內(nèi)舊的培養(yǎng)基。

清洗細(xì)胞：向瓶內(nèi)加入適量 PBS 緩沖液，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，潤洗細(xì)胞 1-2 次，以去除殘留培養(yǎng)基及雜質(zhì)，吸去 PBS。

消化細(xì)胞：加入適量胰酶溶液，覆蓋細(xì)胞層，將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓、脫離瓶壁時，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。血清中的蛋白可中和胰酶活性，防止過度消化。

吹打細(xì)胞：用移液器反復(fù)輕柔吹打細(xì)胞層，使細(xì)胞全部分散成單細(xì)胞懸液。吹打過程要控制力度，避免產(chǎn)生過多氣泡損傷細(xì)胞。

離心收集：將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，以 1000-1500 轉(zhuǎn) / 分鐘的速度離心 3-5 分鐘，使細(xì)胞沉淀在管底。

重懸細(xì)胞：吸去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，用移液器輕柔吹打，將細(xì)胞重懸，制成均勻的細(xì)胞懸液。

3.細(xì)胞計數(shù)

稀釋細(xì)胞懸液：取少量細(xì)胞懸液，用培養(yǎng)基按 1:1 或 1:2 的比例稀釋，避免細(xì)胞濃度過高難以計數(shù)。

加載細(xì)胞懸液：將稀釋后的細(xì)胞懸液滴加在血細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)區(qū)，注意不要產(chǎn)生氣泡，蓋上蓋玻片。

計數(shù)細(xì)胞：在顯微鏡下，計數(shù)計數(shù)板四個大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)。壓線細(xì)胞遵循 “計上不計下，計左不計右" 原則，避免重復(fù)計數(shù)。根據(jù)公式計算細(xì)胞濃度：細(xì)胞濃度（個 /mL）=（四個大格細(xì)胞總數(shù) / 4）× 稀釋倍數(shù) ×10^4 。

4.細(xì)胞鋪板

計算鋪板體積：根據(jù)實驗需求和培養(yǎng)板規(guī)格，確定每孔所需細(xì)胞數(shù)量。如 96 孔板每孔一般接種 5×10^3 - 2×10^4 個細(xì)胞，24 孔板每孔接種 5×10^4 - 2×10^5 個細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞濃度計算所需細(xì)胞懸液體積，如細(xì)胞濃度為 1×10^5 個 /mL，96 孔板每孔需接種 1×10^4 個細(xì)胞，則每孔需加入細(xì)胞懸液體積為 100μL。

鋪板操作：用移液器吸取計算好體積的細(xì)胞懸液，加入培養(yǎng)板相應(yīng)孔中。從培養(yǎng)板一側(cè)邊緣開始，逐孔加入，避免液體濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣過程中，若需接種多塊板，應(yīng)保持移液器操作一致，確保每孔細(xì)胞數(shù)量均勻。

輕柔混勻：加樣完成后，將培養(yǎng)板在水平桌面上輕輕晃動，或使用平板振蕩器，低速振蕩 1-2 分鐘，使細(xì)胞在孔內(nèi)均勻分布。注意振蕩幅度不宜過大，以免細(xì)胞聚集。

5.培養(yǎng)觀察

放入培養(yǎng)箱：將鋪好細(xì)胞的培養(yǎng)板放入 37℃、5% CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CO?可維持培養(yǎng)基 pH 值穩(wěn)定。

定期觀察：培養(yǎng) 2-4 小時后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁及分布情況。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分布不均，可輕微調(diào)整培養(yǎng)板位置，繼續(xù)培養(yǎng)。后續(xù)每天定時觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，包括細(xì)胞形態(tài)、密度等，為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。

細(xì)胞鋪板過程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，動作輕柔，確保細(xì)胞活性及分布均勻性，這樣才能保證實驗順利進行。

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