一、準(zhǔn)備工作

1. 試劑準(zhǔn)備：培養(yǎng)細(xì)胞所需的培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（簡(jiǎn)稱(chēng)FBS）、雙抗（簡(jiǎn)稱(chēng)P/S）、PBS緩沖液等從4°C的冰箱中取出，于室溫條件下放置至恢復(fù)室溫。

2. 耗材準(zhǔn)備：50ml離心管、15ml離心管及移液槍。

3. 實(shí)驗(yàn)條件準(zhǔn)備：打開(kāi)超凈臺(tái)紫外線(xiàn)照射30min之后通風(fēng)3-5min即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1.潔凈要求：進(jìn)入細(xì)胞間后，穿好實(shí)驗(yàn)服，戴好口罩手套等實(shí)驗(yàn)裝備，將上述試劑耗材用酒精噴洗后放入超凈臺(tái)，手部同樣酒精噴洗后放入超凈臺(tái)，手部同樣酒精噴洗即可開(kāi)始。

2.試劑分裝及配制：

（1）配制（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基：（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基（血清占總體積10%，雙抗占總體積1%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合液）一般用50ml離心管配制，減少污染的概率。即在50 ml離心管中加入5ml FBS和500μL P/S后倒入基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容到50ml，即得50ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基。用馬克筆在離心管壁上寫(xiě)好配制時(shí)間及溶液成分。放于一旁試劑架上備用。

（2）分裝PBS：將PBS從瓶中倒入50ml離心管中，倒PBS時(shí)注意瓶口和管口不要接觸，防止整瓶污染。標(biāo)記好后也置于試劑架上備用。

3.細(xì)胞消化及傳代：

（1）細(xì)胞狀態(tài)的觀察及傳代準(zhǔn)備：手部酒精噴洗后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶從恒溫培養(yǎng)箱中取出，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，已經(jīng)生長(zhǎng)到80%-90%的細(xì)胞密度即可傳代。手部再次酒精噴洗，順便將培養(yǎng)皿也噴一下，放入超凈臺(tái)。

（2）清洗：先用移液槍移除原有細(xì)胞培養(yǎng)液，更換槍頭后加入2ml PBS清洗1~2次（沿培養(yǎng)皿壁處加入，防止沖散貼壁細(xì)胞，加入后輕輕搖蕩，洗去殘余的培養(yǎng)液和懸浮的細(xì)胞），用移液槍移除PBS；注意棄掉PBS時(shí)，槍頭應(yīng)在廢液缸上方，不要將槍頭伸入廢液缸中，防止回濺造成污染。

（3）消化：沿培養(yǎng)皿側(cè)壁加入1-2ml胰酶（能夠覆蓋細(xì)胞表面即可）消化約2-5min（水解細(xì)胞間蛋白質(zhì)，使貼壁細(xì)胞脫離附著的底物，解離、分散細(xì)胞），在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則逐漸皺縮為圓形即為全部消化。

（4）終止消化：加入3ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基或?qū)⒓尤氲囊让笚壢ゾ山K止胰酶消化。用移液槍反復(fù)吹打培養(yǎng)皿皿底壁或培養(yǎng)瓶底壁使細(xì)胞脫離皿底壁（注意邊緣地帶和四角處，吹打力度適中，防止產(chǎn)生傷害細(xì)胞的氣泡）。

（5）離心：取吹打后的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，離心機(jī)1000rpm，5min得到單細(xì)胞沉淀。

（6）為節(jié)省時(shí)間，可在離心過(guò)程中準(zhǔn)備傳代所需的培養(yǎng)皿（1:n傳代就準(zhǔn)備n個(gè)培養(yǎng)皿），各加入9 ml（血清）細(xì)胞培養(yǎng)基，在皿蓋上標(biāo)好培養(yǎng)的細(xì)胞種類(lèi)、細(xì)胞代數(shù)、傳代時(shí)間和操作人員。

（7）離心好的細(xì)胞棄上清得到單細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞沉淀用2-3ml完整培養(yǎng)液重新懸浮，分n份分別加入剛剛的培養(yǎng)皿中，并于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞密度。酒精噴洗后放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)即可。（10cm皿一皿培養(yǎng)基10ml；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶一瓶培養(yǎng)基5ml）。

4.結(jié)束操作：

（1）將所有未用完試劑的離心管用封口膜包好，同廢液缸一起拿出超凈臺(tái)。

（2）整理移液槍及耗材位置，用酒精噴濕吸水紙擦拭超凈臺(tái)，關(guān)閉超凈臺(tái)燈光。

（3）廢液倒入廢液回收瓶，廢棄耗材裝入黃色專(zhuān)用垃圾袋，等待統(tǒng)一回收處理。試劑放回4℃冰箱中冷藏。

（4）記錄今日實(shí)驗(yàn)操作內(nèi)容及結(jié)果，方便日后回顧。

三、注意事項(xiàng)

1、細(xì)胞消化中的注意事項(xiàng)

（1）消化細(xì)胞可能會(huì)由于商品化胰酶的品牌、實(shí)驗(yàn)室溫度或細(xì)胞種類(lèi)等造成消化時(shí)間上的差異，建議第一次消化細(xì)胞時(shí)在加入胰酶后就轉(zhuǎn)移至倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并記錄時(shí)間。

（2）消化細(xì)胞熟練之后可以觀察到消化完成后的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶底壁呈現(xiàn)霧面。

（3）若5min后細(xì)胞狀態(tài)沒(méi)有明顯變化，可以將培養(yǎng)皿重新放回培養(yǎng)箱在37℃下孵育消化，或者更換別的品牌的胰酶嘗試。

（4）若消化過(guò)度則細(xì)胞會(huì)隨著分散在胰酶中，此時(shí)棄去胰酶終止消化會(huì)造成細(xì)胞的損失，應(yīng)加入含血清的培養(yǎng)基終止消化后離心去除。

（5）若細(xì)胞未全部消化就終止消化，細(xì)胞會(huì)貼在皿底很難吹打下來(lái)，可以再加入胰酶重新消化。

2、細(xì)胞傳代時(shí)的注意事項(xiàng)

（1）首先可以在ATCC上查找細(xì)胞的傳代比例，然后根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)的狀態(tài)判斷傳代的合適比例。若細(xì)胞傳代過(guò)稀則可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不能擴(kuò)增，若過(guò)密則影響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

（2）細(xì)胞傳代天數(shù)的控制也很重要。若長(zhǎng)時(shí)間不傳代，細(xì)胞培養(yǎng)基顏色變黃，則證明培養(yǎng)基中的pH發(fā)生變化，會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)。

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