1. 什么是生物素？

物素分子量為244.31，分子中有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親合素結(jié)合的主要部位；II環(huán)為噻唑環(huán)，上有一戊酸側(cè)鏈，其末端羧基是結(jié)合抗體和其他生物大分子的結(jié)構(gòu)。利用生物素的羧基加以化學(xué)修飾可制成各種活性基團(tuán)的衍生物，稱為活化生物素，同時(shí)可根據(jù)特殊的用途對這些試劑的化學(xué)性質(zhì)（溶解性、臂長、可剪切與否）進(jìn)行優(yōu)化，以適合與各種生物大分子結(jié)合的需要。

                                                              生物素

2. 什么是生物素化？

生物素化是指將化學(xué)物質(zhì)或分子與生物素（biotin）結(jié)合在一起的過程。生物素是一種水溶性的維生素，也被稱為維生素B7或維生素H，它在許多生物體的生物化學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。生物素可以通過化學(xué)合成或從天然來源（如食物中）獲得。生物素化通常在生物實(shí)驗(yàn)室中用于標(biāo)記和檢測特定的分子或蛋白質(zhì)，其中生物素與待檢測的分子或蛋白質(zhì)結(jié)合，然后可以通過生物素與其他分子之間的特異性相互作用來檢測或純化目標(biāo)分子。

3. 什么是生物素-鏈霉親和素（SA-Biotin）系統(tǒng)？

                                 生物素-SP分子。分子量454.54 Da。左22.4 ?。

圖2. 標(biāo)記鏈酶親和素生物素法（LSAB）。A. 一抗體檢測靶抗原。B. 生物素化二抗可識別一抗。C. HRP偶連鏈酶親和素與生物素化的二抗體結(jié)合，與HRP偶聯(lián)的二抗相比，能夠顯著增強(qiáng)信號。

8. 如何從鏈霉親和素磁珠上解離生物素化分子?

鏈霉親和素-生物素相互作用是已知的蛋白與其他分子間非共價(jià)的生物相互作用。生物素與鏈霉親和素間的鍵形成非常迅速，一旦形成，就不會受到pH、溫度、有機(jī)溶劑和其他變性劑等多種因素的影響。從鏈霉親和素上分離生物素時(shí)，如果實(shí)驗(yàn)中使用的是生物素的衍生物或經(jīng)修飾的鏈霉親和素，那么需要特定形式和通常溫和的方法解離，除此之外通常情況下都需要非常劇烈的方法解離，并且會使鏈霉親和素變性。下面探討了其中兩種方法。

生物素化核酸：為了從Dynabeads鏈霉親和素磁珠上分離生物素化核酸，在pH 8.2的95%甲酰胺+10 mM EDTA中孵育磁珠，65°C孵育5分鐘或90°C孵育2分鐘。使用磁力架將磁珠吸到試管壁上，將含有生物素化核酸的上清液從試管中取出。有研究提到，在高溫(120C，15分鐘)下，才能在鹽溶液中解離。另外，在6 mol/L鹽酸胍溶液(pH 1.5)中也可解離；有研究指出，生物素標(biāo)記的核酸探針不能用酚抽提，否則生物素核酸會進(jìn)入酚層而損失；Holmberg等（Electrophoresis 26, 501-510, 2005）報(bào)道稱，在用離子水短時(shí)間孵育后，可將生物素化DNA從鏈霉親合素磁珠上釋放（未進(jìn)行測試）。

生物素化蛋白質(zhì)：對于生物素化蛋白質(zhì)，則可在0.1% SDS或SDS-PAGE緩沖液中煮沸磁珠3分鐘。

9. 鏈霉親和素磁珠結(jié)合片段的長度和結(jié)合能力為多少?

由于具有空間位阻，因此結(jié)合能力取決于片段大小。例如，500 bp片段在Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠上的結(jié)合量是1,000 bp片段的2倍。長DNA片段會占據(jù)磁珠周圍更多空間，使其更難“找到"磁珠上的鏈霉親和素。較短的片段更易接近鏈霉親和素。對于大于2kb的DNA片段，推薦使用Dynabeads kilobaseBINDER™試劑盒。該試劑盒包括Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠和一種可增強(qiáng)長生物素化DNA片段（大于2kb）固定的結(jié)合液。對于大于1-2kb的DNA片段，推薦使用Dynabeads kilobaseBINDER™試劑盒，因?yàn)榻Y(jié)合液可增強(qiáng)結(jié)合能力。該結(jié)合液可使DNA線性化，進(jìn)而伸展且堿基堆疊成剛性結(jié)構(gòu)（不適用于質(zhì)粒或環(huán)狀核酸等較短的片段）。

鹽濃度可影響生物素化核酸與Dynabeads鏈霉親和素磁珠的結(jié)合效率。對于1kb以內(nèi)的生物素化DNA片段，最佳結(jié)合條件為1M NaCl（終濃度），25℃孵育15分鐘；較長的DNA片段應(yīng)固定過夜。生物素化抗體應(yīng)在含0.1% BSA，pH 7.4的PBS緩沖液中固定。由于游離生物素與Dynabeads鏈霉親和素磁珠結(jié)合的速度比大分子更快，因此應(yīng)確保樣本不含過量的游離生物素。應(yīng)使用HPLC或FPLC回收生物素化寡核苷酸，以避免樣本中游離生物素的存在。由于待固定的特定分子的大小和生物素化過程都將影響磁珠的結(jié)合能力，因此，可采用滴定法優(yōu)化每個(gè)單獨(dú)應(yīng)用中的磁珠使用量。

10. Dynabeads鏈酶親和素磁珠是無RNase的嗎?

Dynabeads鏈霉親和素磁珠不是以無RNase溶液的形式提供的。處理RNA時(shí)，應(yīng)使用DEPC處理的0.1M NaOH/0.05 M NaCl溶液清洗磁珠2次，每次1-3分鐘。DEPC毒性很強(qiáng)。但能去除RNase。清洗后，可使用DEPC處理的0.1 MNaCl溶液重懸磁珠。"DEPC處理"是指：加入0.1% DEPC，混合，室溫下解育1小時(shí)。隨后，將DEPC處理的溶液進(jìn)行高壓滅菌，以破壞DEPC。

11. 如何去除雙鏈DNA中的非生物素化鏈？

可通過堿處理或高溫處理分離DNA雙鏈。采取堿處理時(shí)，可使用0.1 M NaOH洗脫非生物素化鏈。通常情況下，該處理方法不會對磁珠產(chǎn)生任何影響。在NaOH處理前，在2X結(jié)合和洗滌緩沖液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，2 M NaCl）中清洗Dynabeads/DNA復(fù)合物1次，除去上清液。高鹽濃度將有助于減少電荷，從而使非特異性結(jié)合最小化。向Dynabeads/DNA復(fù)合物中加入新鮮配制（很重要）的0.1 M NaOH溶液，室溫下旋轉(zhuǎn)孵育2-3分鐘（最多5分鐘）。除去含有非生物素化鏈的上清液。再用0.1 M NaOH溶液清洗Dynabeads/DNA復(fù)合物1次，除去上清液。第一次洗脫時(shí)，即可洗脫下大部分DNA。除了堿處理，也可進(jìn)行加熱處理，在水中95°C加熱5分鐘即可。為防止再退火，堿處理或高溫處理后必須快速從磁珠上分離DNA，最好在冰上操作。加熱會在一定程度（在水中約為7%）上引起生物素化DNA從鏈霉親和素上解離。因此，通常更推薦采用堿處理法。

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