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    標(biāo)記抗體的應(yīng)用技術(shù)

    發(fā)布時(shí)間: 2023-04-12  點(diǎn)擊次數(shù): 1042次

    原理

    ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,每加入一種試劑孵育后,可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中,通過(guò)不同的設(shè)計(jì),具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測(cè)抗體的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
     

    材料與儀器

    BSA 血清
    碳酸鹽緩沖液 PBS 蒸餾水 磷酸棗檸檬酸 四甲基聯(lián)苯胺
    塑料板 ELISA檢測(cè)儀 加樣器 滴頭 毛巾 洗滌瓶 燒杯 玻璃棒 試管 吸管 量筒 冰箱 孵育箱

    步驟

    一、用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法

    1. 包被

    用0.05 M PH9 牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10 μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 ml,4 ℃過(guò)夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌,下同)。

    2. 加樣

    加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37 ℃孵育1 小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔,陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。
      
    3. 加酶標(biāo)抗體

    于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1 ml。37 ℃孵育0.5~1 小時(shí),洗滌。
      
    4. 加底物液顯色

    于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 ml,37 ℃10~30 分鐘。
      
    5. 終止反應(yīng)

    于各反應(yīng)孔中加入2 M硫酸0.05 ml。
     
    6. 結(jié)果判定

    (1)可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果。

    反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽(yáng)性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“+"、“-"號(hào)表示。

    (2)可測(cè)OD值

    在ELISA檢測(cè)儀上,于450 nm(若以ABTS顯色,則410 nm)處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍,即為陽(yáng)性。

    二、用于檢測(cè)未知抗體的間接法

    1. 用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10 μg/ml,每孔加0.1 ml,4 ℃過(guò)夜。次日洗滌3 次。
                  
    2. 加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1 ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37 ℃孵育1小時(shí),洗滌。(同時(shí)做空白、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照)
                  
    3. 于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗體)0.1 ml,37 ℃孵育30-60 分鐘,洗滌,最后一遍用DDW洗滌。
               
    4. 其余步驟同“雙抗體夾心法"的4、5、6。
      

    注意事項(xiàng)

    1. 正式試驗(yàn)時(shí),應(yīng)分別以陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份,以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高,說(shuō)明有非特異性反應(yīng),可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
      
    2. 在ELISA中,進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的,其中包括
      
    (1)固相載體的選擇

    許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進(jìn)行篩選:用等量抗原包被,在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng),觀察其顯色反應(yīng)是否均一性,據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
      
    (2)包被抗體(或抗原)的選擇

    將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí),要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4 ℃18~24 小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定:即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10 μg/ml等)進(jìn)行包被后,在其它試驗(yàn)條件相同時(shí),觀察陽(yáng)性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)通常為1~10 μg/ml。
      
    (3)酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇

    首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定。然后再固定其它條件或采取“方陣法“(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
      
    (4)酶的底物及供氫體的選擇

    對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng),而本身無(wú)色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后,應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制,尤其是H2O2在臨用前加入。


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