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混合淋巴細胞增殖

發(fā)布時間： 2023-01-11　　點擊次數(shù)： 901次

簡介
混合淋巴細胞增殖實驗也稱混合淋巴細胞培養(yǎng)（MLC）或稱混合淋巴細胞反應(yīng)（MLR），常用于器-官-移-植前的組織配型，以測定受體和供體主要組織相容性抗原（HLA 抗原）相容的程度。
材料與儀器
器材：細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、吸管等、CO2 細胞培養(yǎng)箱、超凈臺。
試劑：
① 10％FCS-RPMI 1640 培養(yǎng)基 ;
② 細胞 DCs 細胞、反應(yīng)細胞、外周血單個核細胞。
③ 3 H-TdR 工作液

步驟
混合淋巴細胞增殖實驗的基本過程可分為如下幾步：
（一）刺激細胞（DCs）的制備
A. 取健康志愿者肝素抗凝的外周血，淋巴細胞分離液分離單個核細胞
B. 以 10％ FCS-RPMI 1640 懸浮細胞置培養(yǎng)瓶中，37℃、5％ CO2 培養(yǎng) 2 小時，輕輕翻過培養(yǎng)瓶，棄掉培養(yǎng)上清，將非貼壁細胞棄掉，即得貼壁的單核細胞
C. 補加 10％ FCS-RPMI 1640 同時加入 20 ng/ml 的 hGM-CSF，500 IU/ml 的 IL-4，培養(yǎng)至第 7 天，收集懸浮細胞，即為 DCs
D. 刺激細胞經(jīng) 25 μg/ml 的絲-裂-霉-素 C 或 2000 rad y-射線照射處理使刺激細胞失去增殖能力。
（二）反應(yīng)細胞的制備
A 取健康人外周血制備單核細胞，PBS 洗 3 次后，37℃、5％ CO2 貼壁 2 小時，收集懸浮細胞，作為反應(yīng)細胞
B 以 RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞濃度至 1x106 個/ml。
（三）混合淋巴細胞反應(yīng)
A 將刺激細胞調(diào)整濃度分別為 1x106、5x105、2x10、1x105、5x104 個/ml， 10％FCS-RPMI 1640 培養(yǎng)于 96 孔培養(yǎng)板中，每濃度設(shè)立 3 孔，100μL/孔
B 將反應(yīng)細胞濃度按 1x106 個/ml 每孔分別加入上述各孔中，100μl/孔
C 同時設(shè)立刺激細胞對照組（不同濃度刺激細胞 100μl＋培養(yǎng)液 100μl）和反應(yīng)細胞對照組（反應(yīng)細胞 100μl＋培養(yǎng)液 100μl）
D 37℃，5％ CO2 培養(yǎng) 5 天后，3 H-TdR 摻入率檢測反應(yīng)細胞的增殖水平。

注意事項
1. 實驗中注意無菌操作
2. 如作單向混合淋巴細胞實驗，則刺激細胞接受照射劑量要準(zhǔn)確，使細胞暫時存活，但失去增殖的能力。

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