蛋白的含量的測(cè)定方法主要有紫外分光光度法、Lowry法、BCA法等。

紫外分光光度法

原理

蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)在275~280mm有一紫外吸收峰。在一定濃度范圍內(nèi)，其在280mm的吸光度與蛋白濃度成正比。

方法

取適量蛋白溶液（約3.5ml），置于光徑為1cm的石英比色杯、用與溶解蛋白的緩沖液相同的緩沖液為對(duì)照，在280mm波長處測(cè)定吸光度，吸光度為1.0的蛋白溶液，蛋白濃度約為1.0mg/ml。當(dāng)溶液中含少量核酸時(shí)，應(yīng)同時(shí)測(cè)定260nm波長處的吸光度，以下式估算蛋白濃度：蛋白濃度（mg/ml）=1.55A280-0.75A260。該測(cè)定方法誤差較大，有紫外光吸收的物質(zhì)（如核酸）干擾大。

材料和儀器

（1）4%Na?CO3；（2）0.2mol/LNaOH；（3）1%CuSO4；（4）2%酒石酸鈉。試劑A：使用前，將(1)(2)(3)(4)試劑以50：50：1：1的比例混合均勻，當(dāng)天使用。試劑B：酚試劑。

Lorry法

Lowry法靈敏度較高，線性范圍為20~100ug/ml。該方法干擾因素主要有：高濃度的胍鹽、尿素等變性劑，Triton、Tween等去垢劑，EIDTA等整合劑，以及Tris、甘氨酸等等。

材料和儀器

材料：（1）4%Na?CO3；（2）0.2mol/LNaOH；（3）1%CuSO4；（4）2%酒石酸鈉。試劑A：使用前，將(1)(2)(3)(4)試劑以50：50：1：1的比例混合均勻，當(dāng)天使用。試劑B：酚試劑。

儀器：分光光度計(jì)。

操作步驟

（1）準(zhǔn)確稱取10mg標(biāo)準(zhǔn)蛋白（常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白）加蒸餾水溶解定容至100ml。

（2）取6支試管分別編為0~5號(hào)，分別加入步驟（1）制備的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40ml，并都用蒸餾水補(bǔ)足至0.4ml。

（3）各試管加入試劑A 2ml，混勻，室溫放置10分鐘。

（4）各試管加入試劑B 0.2ml，立即混勻，室溫或37℃水浴中，保溫30分鐘。

（5）在分光光度計(jì)上，以0號(hào)為參比，測(cè)定各管樣品在750mm的吸光度值。

（6）以蛋白濃度為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或作直線回歸。

（7）取樣品溶液0.4ml，按步驟（1）~（5）測(cè)定，將測(cè)得的吸光度值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白濃度。

注意：如果樣品濃度過高，可用蒸餾水作適當(dāng)稀釋。

BCA法

BCA法的優(yōu)點(diǎn)是抗干擾能力強(qiáng)，其原理是：在堿性溶液中，蛋白將二價(jià)銅還原成一價(jià)銅，后者與試劑中的BCA（二辛可酸，Bicinchoninic acid）形成一個(gè)在562mm處具有最大吸光度的紫色復(fù)合物，其吸光度與蛋白濃度成正比，線性范圍20~100ug/ml。

材料和儀器

試劑A：1%BCA二鈉鹽，2%碳酸鈉，0.16%酒石酸鈉，0.4%氫氧化鈉和0.95%碳酸氫鈉。用50%NaOH或碳酸氫鈉調(diào)pH11.25。

試劑B：4%硫酸銅

工作液：100倍體積試劑A與2倍體積試劑B混合。

操作步驟

（1）準(zhǔn)確稱取10mg標(biāo)準(zhǔn)蛋白（常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白）加蒸餾水溶解定容至100ml。

（2）取6支試管分別編為0~5號(hào)，分別加入步驟1制備的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0、20、40、60、80、100 ul，并都用蒸餾水補(bǔ)足至100ul。

（3）各試管加入工作液2ml，混勻，37℃水浴保溫30分鐘。

（4）在分光光度計(jì)上，以0號(hào)為參比，測(cè)定各管樣品在562mm的吸光度值。

（5）以蛋白濃度為橫座標(biāo)，吸光度為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，或作直線回歸：

（6）取樣品溶液100 ul，按步驟1~4測(cè)定，將測(cè)得的吸光度值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白濃度。

注意：如果樣品濃度過高，可用蒸餾水作適當(dāng)稀釋。

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