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    成纖維細胞生長因子誘導(dǎo)血管生成模型實驗

    發(fā)布時間: 2021-11-08  點擊次數(shù): 1208次
    材料與儀器

    成纖維細胞
    肝素 PBS 牛血清蛋白 FGF
    CO2培養(yǎng)箱 96孔培養(yǎng)板 光學(xué)顯微鏡 酶標儀

    實驗步驟

    一、成纖維細胞生長因子和肝素誘導(dǎo)基底膜蛋白提取物內(nèi)的血管生成模型

    1.  Matrigel 為一種基底膜提取物,主要由粘連蛋白、膠原蛋白、硫酸肝素。蛋白多糖和 nidogen/entactin 構(gòu)成,經(jīng)濾膜,制備成無菌液體。

    2.  肝素溶解于無菌的PBS(pH7.4)中,濃度為16 000單位/ml,酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)經(jīng)預(yù)先配備的無菌牛血清清蛋白/PBS溶液稀釋為0.25 ug/ml。

    3.  于4℃把各種濃度的肝素或FGF與0.5~1.0ml 的 matrigel 混合,前者體積不超過后者的1%。

    4.  把含有0~100 ng/ml aFGFHE 0~64 ug/ml 肝素的0.5 ml matrigel 用21號針注射到C57小鼠腹白線皮下。

    5.  注射后matrigel 在皮下迅速形成單一的固體膠,10天后乙(酉迷)麻醉小鼠,沿腹白線剪開皮膚,剝離出膠塊。

    6.  一部分應(yīng)用Drabkin’方法進行血紅蛋白測定,另一部分經(jīng)過10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片、染色。

    7.  于光鏡下進行組織學(xué)檢查,記錄血管形成的數(shù)量。

    8.  近年來,還有圓盤狀血管生成系統(tǒng)、大鼠海綿血管生成模型等用于抗血管生成藥物體內(nèi)試驗。

    二、內(nèi)皮細胞粘附分析

    1.  把對數(shù)生長期的內(nèi)皮細胞,用無血清培養(yǎng)液洗三次,收集并重新懸浮含有0.1%BSA的無血清培養(yǎng)液中,濃度為5×105細胞/ml。

    2.  也可預(yù)先將細胞與無血清培養(yǎng)液稀釋的不同濃度抑制劑在室溫下,孵育60 min。

    3.  將細胞種入96孔培養(yǎng)板內(nèi)(10 ul/孔),與37℃孵育30~90 min。

    4.  用Dulbecco‘PBS液清洗細胞4 次,除去未粘附細胞,粘附細胞用20%甲醇稀釋的0.5%結(jié)晶紫染色、固定、漂洗和空氣晾干。

    5.  用比例為1:1的乙醇和0.1 mol/l 構(gòu)櫞酸鈉溶液洗滌染色細胞,用酶標儀在540 nm 測定吸收度(OD)。


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